روش MPN برای شمارش کلی فرم های نمونه های آب سطحی

 

هدف آزمایش:

  • تعیین تعداد (شاخص MPN) توتال کلی­فرم و فکال کلی­فرم
  • تعیین میزان آلودگی مدفوعی در نمونه­های آب سطحی

نمونه­های مورد سنجش:

  • نمونه­های آب سطحی با میزان آلودگی پایین

کاربرد آزمایش:

  • کنترل کیفیت میکروبی منابع آب خام مورد استفاده در تصفیه­خانه­های آب آشامیدنی
  • کنترل آلودگی­های پایین حاصل از ورود پساب به آب­های جاری

استاندارد: استانداردهای شماره 9221 B.، 9221 C. و 9221 E از Standard Methods, 21st Ed., 2005

 

روش کار:

این آزمون به شیوه تخمیر چندلوله­ای انجام می­شود و شامل سه مرحله احتمالی، تأییدی و تکمیلی می­باشد.

در مرحله احتمالی از 15 لوله استفاده می­شود که یک سری پنج­تایی آن هر یک محتوی ml 10 محیط دوغلظتی (یا ml 20 محیط 5/1 غلظتی) بوده و ده لوله دیگر هر یک محتوی ml 10 محیط با غلظت معمول است. به هر یک از لوله­های سری اول ml 10  و به پنج لوله با غلظت معمول ml 1 و به پنج لوله باقیمانده ml 1/0 از نمونه تلقیح می­شود. البته طبق دستورالعمل استاندارد مورد استفاده به منظور کاهش خطا برای تلقیح ml 1/0 باید از نمونه رقت 1-10 تهیه کرد و از رقت مذکور ml 1 به هر یک از 5 لوله اخیر تلقیح کرد.  

پس از تلقیح نمونه به لوله­ها در دمای OC 5/0± 35 انکوبه­گذاری می­شوند. پس از  2±24 ساعت مشاهده کدورت و گاز نشان دهنده مثبت بودن هر یک از لوله­هاست. درمورد لوله­هایی که در آن­ها کدورت بدون گاز دیده شود این مرحله تا 3±48 ساعت ادامه می­یابد.

در مرحله تأییدی از هر یک از لوله­های مثبت مرحله احتمالی به یک لوله محتوی ml 10 محیط کشت برلیان گرین بایل لاکتوز براث و نیز یک لوله محتوی همین حجم EC براث تلقیح شده و به­ترتیب در دمای OC 5/0± 35 در انکوباتور (برای تعیین توتال کلی­فرم­ها) و در دمای OC 2/0±5/44 در بن­ماری (برای تعیین فکال کلی­فرم­ها) انکوبه­گذاری می­شوند. تولید گاز در لوله­های برلیان گرین (در هر زمان حداکثر تا 3±48 ساعت) نشان­دهنده رشد توتال کلی­فرم­ها و در لوله­های EC براث (در هر زمان حداکثر تا 2±24 ساعت) نشان­دهنده رشد فکال کلی­فرم­ها در لوله­های مذکور بوده و این لوله­ها به­عنوان لوله مثبت مرحله تأییدی ثبت می­شود. در این مرحله با توجه به نتایج به­دست آمده و با داشتن تعداد لوله­های مثبت مرحله تأییدی برای توتال و فکال به جداول MPN 15 لوله­ای مراجعه کرده (و یا با استفاده از فرمول) و عدد MPN که در واقع حداکثر تعداد احتمالی توتال کلی­فرم­ها و فکال کلی­فرم­ها در نمونه مورد آزمایش است ثبت می­شود. واحد این عدد MPN Index/100 mL می­باشد.

برای اطمینان از حضور کلی­فرم­ها در لوله­های مرحله تأییدی و یا کنترل کیفیت این روش در یک آزمایشگاه می­توان از لوله­های مثبت مرحله تأییدی روی سطح محیط کشت مک کانکی آگار کشت خطی داده و تشکیل کلنی­های تیپیک و آتیپیک کلی­فرم­ها را بررسی کرد. همچنین از این کلنی­ها می­توان مجدداً در محیط لاکتوز براث کشت داد. همچنین از این کلنی­ها می­توان مجدداً در محیط لاکتوز براث کشت داد و همزمان جهت رنگ­آمیزی بعدی روی سطح شیب­دار (اسلنت) نوترینت آگار کشت داد.