روش های شمارش یا سنجش کلی فرم ها در نمونه های آب

روش های شمارش یا سنجش کلی فرم ها در نمونه های آب

به طور کلی برای شمارش کلی فرم ها در آب سه سری روش قابل انجام است. این روش ها عبارتند از:

- آزمون تخمیر چند لوله ای (multiple-tube ferementation test)

- روش فیلتر غشایی (membrane filter method)

- روش های سوبسترای آنزیمی (enzyme substrate methods)

هر روش مزایا و معایبی دارد و بر این اساس هر یک در مورد نوع و حالت خاصی از نمونه های آبی توصیه می شوند. در ادامه توضیحی کلی در مورد هر یک از این سه سری روش در رابطه با شمارش یا سنجش کلی فرم ها ارایه می شود. ................

ادامه نوشته

توتال کلی فرم و فکال کلی فرم

کلی فرم ها به عنوان شاخص میکروبی مناسبی برای نشان دادن آلودگی مدفوعی در نمونه های آب مورد استفاده قرار می گیرند. از جمله ویژگی هایی که باعث شده این گروه از باکتری ها به عنوان شاخص میکروبی برای نشان دادن آلودگی مدفوعی آب مورد استفاده قرار گیرند عبارتند از:

- زیستگاه طبیعی آن ها در دستگاه گوارشی حیوانات خونگرم است لذا در مدفوع به تعداد زیاد حضور دارند.

- دوام آن ها در آب بیش از باکتری های بیماریزای روده ای است که این باعث می شود هر گاه باکتری های بیماریزای روده ای در آب حضور دارند کلی فرم ها هم وجود داشته باشند.  

- در آب تکثیر قابل توجهی ندارند زیرا زیستگاه طبیعی آن ها آب نیست بنابراین تعداد نسبی آن ها نسبت آلودگی مدفوعی در نمونه ای مختلف آب را نشان خواهد داد.

- کشت، شمارش و جداسازی آن ها در آزمایشگاه ساده تر از باکتری های بیماریزای روده ای است

با این وجود با گذشت زمان مشخص شد که همه باکتری هایی که در گروه کلی فرم ها قرار می گیرند منشأ مدفوعی ندارند بلکه برخی منشأیی غیر از مدفوع مثلاً از خاک دارند. بنابراین زیرگروهی در گروه کلی فرم ها تعریف شد که با توجه به اینکه منشأ آن ها از مدفوع بود و نه از زیستگاه های دیگر به آن ها کلی فرم های مدفوعی (fecal coliforms) می گویند. به کل کلی فرم ها (شامل مدفوعی و غیرمدفوعی) نیز توتال کلی فرم (total coliforms) می گویند.

کلی فرم های مدفوعی یا همان فکال کلی فرم ها باکتری هایی ترموتالرنت (مقاوم به گرما) یا اصطلاحاً گرماپای می باشند بدین معنی که قادرند تخمیر لاکتوز را با همان شرایطی که برای توتال کلی فرم ها ذکر شد انجام دهند ولی می توانند این فعالیت را در دمای 5/44 درجه سانتیگراد نیز انجام دهند.

بنابراین در روش های آزمایشگاهی شمارش توتال کلی فرم ها و فکال کلی فرم ها توانایی تخمیر لاکتوز با تولید اسید و گاز به ترتیب در دمای 35 درجه و 5/44 درجه مورد نظر قرار می گیرد.

کلی فرم چیست؟

اصطلاح کلی فرم به گروهی از باکتری های خانواده انتروباکتریاسه (باکتری های روده ای) گفته می شود که دارای توانایی خاصی در تخمیر قند لاکتوز باشند. در واقع این باکتری ها نیز همانند سایر اعضای خانواده انتروباکتریاسه باکتری هایی میله ای گرم-منفی، اکسیداز-منفی و کاتالاز-منفی هستند. با این وجود، توانایی تخمیر قند لاکتوز در زمان ۲۴ (تا حداکثر ۴۸) ساعت در دمای ۳۵ درجه سانتیگراد به همراه تولید گاز و اسید در چنین تخمیری باعث شده که گروهی از اعضای این خانواده با هم در گروهی به نام کلی فرم ها قرار گیرند. همانطور که مشخص است این دسته بندی سیستماتیک نیست و تنها بر اساس توانایی انجام نوعی فعالیت متابولیکی در شرایطی خاص تعریف می شود. بنابراین اگرچه گاهی در برخی منابع اعضای کلی فرم ها Escherichia coli، Enterobacter aerogenes، Klebsiella pneumoniae و Citobacter معرفی می شوند ولی بیان صحیح این است که تنها سویه هایی از این باکتری ها در گروه کلی فرم ها جای می گیرند که بتوانند تخمیر لاکتوز را با همان شرتیطی که گفته شد انجام دهند. مثلاً هستند سویه هایی از E. coli که تخمیر قند لاکتوز را بدون تولید گاز انجام می دهند (سویه های انروژنتیک) و یا اینکه سویه هایی هستند از این گونه که تخمیر لاکتوز را با تولید گاز و اسید انجام می دهند ولی در مدتی طولانی تر از 48 ساعت لذا چنین سویه هایی در گروه کلی فرم ها قرار نمی گیرند. با در نظر گرفتن فراوانی بالای انتقال مواد ژنتیکی بین باکتری ها به ویژه باکتری های نزدیک به یکدیگر مشخص است که امکان اینکه علاوه بر گونه هایی که در بالا ذکر شدند سویه های باکتری دیگری از خانواده انتروباکتریاسه نیز در گروه کلی فرم ها قرار بگیرند وجود دارد.

 

 

کلیات شمارش کلی فرم ها (توتال و فکال) در نمونه های آبی به روش آزمون تخمیر چند لوله ای (روش MPN)

یکی از روش های مرسوم و مورد اعتماد برای شمارش باکتری های کلی فرم در نمونه های آبی استفاده از روش تخمیر چندلوله ای یا اصطلاحاً روش MPN است.

در این آزمون برای شمارش کلی فرم ها از محیط کشتی استفاده می شود که محتوی قند لاکتوز باشد. معمولاً از محیط لاکتوز براث (lactose broth) و یا محیط لوریل تریپتوز براث (lauryl tryptose broth) برای این منظور استفاده می شود. پس از تهیه محیط کشت آن را به مقادیر مناسب در لوله هایی توزیع می کنند. سپس مقدار معینی از نمونه به هر لوله وارد می شود یا اصطلاحاً تلقیح می گردد. سپس لوله ها برای مدت 24 ساعت و حداکثر 48 ساعت در دمای 35 درجه سانتیگراد قرار داده می شوند تا تخمیر لاکتوز در آن ها بررسی شود. برای بررسی تولید گاز در اثر تخمیر نیز قبل از استریل کردن لوله های محتوی محیط کشت در هر لوله یک لوله کوچک موسوم به لوله دورهام به صورت وارونه انداخته می شود. در صورتی که باکتری کلی فرم باشد از تخمیر لاکتوز گاز CO₂ تولید می کند که مقداری از آن در لوله دورهام جمع می شود. البته می توان به جای بررسی تولید گاز به بررسی تولید اسید در لوله ها پرداخت. برای این منظور در زمان تهیه محیط کشت در آن مقداری معرف pH تحت عنوان bromocresol purple افزوده می شود. در اثر تولید اسید توسط باکتری در هر لوله محیط اسیدی می شود و رنگ معرف از ارغوانی به زرد تغییر می کند. تا اینجا مرحله احتمالی آزمون است. از آنجایی که در این مرحله علاوه بر کلی فرم ها باکتری های دیگری هم هستند که می توانند نتیجه ای مشابه کلی فرم ها بدهند در مرحله بعد لازم است حضور کلی فرم ها در هر یک از این لوله های مثبت تأیید شود. برای این منظور از هر یک از لوله هایی که از نظر حضور کلی فرم مثبت هستند (احتمالاً در آن ها کلی فرم رشد کرده) به لوله های محتوی محیط کشت انتخابی تری به نام برلیان گرین براث (brilliant green bile lactose broth یا BG broth) منتقل می کنند. این محیط کشت دارای ترکیباتی از قبیل نمک های صفراوی و برلیان گرین است که رشد باکتری های غیر کلی فرمی که ممکن است در مرحله احتمالی نتیجه مثبت در لوله های را سبب شده باشند داده باشند را متوقف می کنند. این لوله ها نیز به مدت ۲۴ ساعت و حداکثر ۴۸ ساعت در دمای 5_/0±35 درجه قرار داده می شوند. رشد (کدورت) به همراه تولید گاز تأیید کننده حضور کلی فرم ها در لوله هایی است که از آن ها برای کشت در BG broth استفاده شده است (مرحله تأییدی). برای اطمینان از حضور کلی فرم ها در هر لوله از لوله های تأییدی و یا به عبارت دیگر انجام مرحله تکمیلی از هر یک از لوله های مثبت مرحله تأییدی با استفاده از لوپ سیمی روی محیط کشت جامد مک کانکی آگار یا محیط های مشابه از قبیل EMB agar کشت خطی داده می شود. پس از ۲۴ ساعت انکوبه گذرای در دمای 5_/0±35 درجه سانتیگراد درصورتی که کلنی های کلی فرم ها که به رنگ قرمز تیره با یا بدون جلای فلزی و یا به رنگ صورتی هستند روی محیط دیده شوند به معنای اطمینان از حضور کلی فرم ها در لوله برلیان گرین که از آن انتقال انجام شده می باشد. کلنی های قرمز تیره را کلنی های تیپیک و کلنی های صورتی را کلنی های آتیپیک کلی فرم ها می خوانند. طبق دستورالعمل Standard Methods ویرایش ۲۱ (چاپ ۲۰۰۵) برای اطمینان از هر پلیت چند کلنی کلی فرم  انتخاب و  جهت رنگ آمیزی گرم روی اسلنت های نوترینت آگار کشت می شوند. همچنین از هر یک از این کلنی ها به محیط کشت مرحله احتمالی تلقیح می شود و ایجاد کدورت به همراه گاز یا اسید بررسی می شود.

البته لازم به توضیح است که در اغلب آزمایشگاه ها تنها دو مرحله احتمالی و تأییدی انجام می شوند.

از آنجایی که این روش شمارش روشی آماری است که از قوانین احتمالات با توجه به نحوه توزیع نمونه در لوله های محیط کشت تبعیت می کند به آن روش MPN می گویند. این اصطلاح از حرف اول سه کلمه Most Probable Number به معنای حداکثر تعداد احتمالی گرفته شده است.

نحوه محاسبه تعداد کلی فرم ها در هر ۱۰۰ میلی لیتر نمونه مورد آزمایش به این صورت است که تعداد لوله های مثبت مرحله تأییدی (و درصورتی که مرحله احتمالی انجام شود تعداد پلیت های مثبت مرحله تکمیلی) در سری لوله ها ثبت می شود. سپس تعداد کلی فرم ها را با پیدا کردن این عدد (کد) در جدولی موسوم به جدول MPN (و یا در برخی موارد با استفاده از فرمول هایی خاص که درمورد برخی روش های MPN در دسترس است) به دست می آورند. این عدد حداکثر تعداد کلی فرم ها در ۱۰۰ میلی لیتر نمونه آبی بوده و واحد آن به صورت MPN Index/100mL نوشته می شود.

آنچه در بالا گفته شد مربوط به توتال کلی فرم هاست. درصورتی که هدف شمارش کلی فرم های گرماپای یا همان کلی فرم های مدفوعی (فکال) باشد به جای محیط کشت برلیان گرین براث در مرحله تأییدی از محیط کشت EC broth استفاده می شود. تفاوت دیگر این است که در اینجا برای کشت به جای 5_/0±35 از دمای 2_/0±5_/44 استفاده می شود. با توجه به اینکه در این دما حساسیت باکتری ها نسبت به بالا رفتن درجه حرارت بالا می رود به جای انکوباتور از حمام آبگرم (بن ماری) استفاده می شود تا دمایی یکنواخت در اطراف لوله محیط کشت EC broth وجود داشته باشد. نتیجه این کشت برخلاف مرحله تأییدی MPN توتال کلی فرم که تا ۴۸ ساعت قابل بررسی است پس از 2±24 ساعت ثبت می شود.

آنچه در اینجا گفته شد کلیات مراحل MPN برای کلی فرم ها (توتال و فکال) است. با این وجود، لازم به ذکر است که بر اساس اینکه نمونه مورد آزمایش چه ماهیتی دارد سه نوع MPN را می توان از هم جدا کرد که عبارتند از:

-         روش MPN برای نمونه های آب سطحی

-         روش MPN برای نمونه های فاضلاب

-         روش MPN برای نمونه های آب تصفیه شده

این سه نوع MPN در تعداد لوله های کشت، میزان نمونه وارد شده در هر لوله، غلظت محیط کشت در هر لوله و در برخی موارد در نحوه ثبت نتایج مرحله احتمالی تفاوت هایی دارند.