رنگ آمیزی گرم (Gram staining):

یکی از انواع رنگ آمیزی ها در میکروبیولوژی که به جرأت می توان آن را پرکاربردترین رنگ آمیزی به حساب آورد روش رنگ آمیزی گرم است. این روش در سال 1884 برای اولین بار توسط محققی دانمارکی به نام «Christian Gram» انجام شد و بعدها با تغییراتی برای دسته بندی باکتری ها مورد استفاده قرار گرفت.

پس از انجام این رنگ آمیزی طبق روش آن که در ادامه بحث خواهد شد باکتری هایی که ضخامت لایه پپتیدوگلیکان در دیواره آن ها زیاد است در زیر میکروسکوپ به رنگ بنفش دیده می شوند و باکتری هایی که ضخامت لایه پپتیدوگلیکان ان ها اندک است به رنگ قرمز دیده می شوند. به صورت قراردادی به باکتری هایی که سلول آن ها پس از این رنگآامیزی بنفش دیده می شود باکتری های گرم-مثبت (Gram-positive) و به باکتری هایی که سلول آن ها در زیر میکروسکوپ قرمز دیده می شود باکتری های گرم-منفی (Gram-negative) گفته می شود.

کاربرد: امروزه اولین آزمونی که معمولاً برای شناسایی یک باکتری ناشناس انجام می شود رنگ آمیزی گرم می باشد. در نتیجه انجام این روش علاوه بر پی بردن به گرم مثبت یا منفی بودن یک باکتری می توان شکل آن (باسیل، کوکسی و یا اسپریل) را نیز تشخیص داد. بنابراین باکتری ناشناس رنگ آمیزی شده را می توان در یکی از چهار گروه اصلی زیر قرار داد و ادامه ازمایشات مربوط به شناسایی آن باکتری را از آزمون های توصیه شده برای آن گروه انتخاب کرد:

کوکسی گرم-مثبت: مثل استرپتوکوک ها و استافیلوکوک ها

کوکسی گرم-منفی: مثل مننگوکوک ها

باسبل گرم-مثبت: مثل باسیلوس ها و کلستریدیوم ها

باسیل گرم-منفی: مثل اعضای خانواده انتروباکتریاسه (باکتری های روده ای) و ویبریوها

 

نکته: لازم به ذکر است که برخی باکتری ها در روش گرم رنگ نمی گیرند. این گروه ها به عنوان استثناهایی در این زمینه ذکر می شوند. از جمله این باکتری ها می توان مایکوباکتریوم ها (اتز جمله گونه ای که عامل بیماری سل است) و نیز نوکاردیاها (از جمله انواعی که در تصفیه فاضلاب در ایجاد فوم یا کف در حوضچه های هوادهی نقش دارند) را نام برد. برای رنگ آمیزی این باکتری ها روش های خاصی وجود دارد.

 

روش کار:

برای انجام رنگ آمیزی گرم روش ها و اصلاحات مختلفی وجود دارد. به عنوان مثال در کتابی که با عنوان «رنگ ها و کاربرد آنها در میکروب شناسی و علوم آزمایشگاهی» توسط دکتر روحا کسری کرمانشاهی و خانم آرزو توکلی به (از انتتشارات جهاد دانشگاهی-واحد اصفهان) به نگارش درآمده علاوه بر روش اصلی گرم هشت روش دیگر نیز ذکر شده است. در اینجا به توصیف کلیات روش معمول این رنگ آمیزی که در اکثر آزمیاشگاه ها انجام می شود پرداخته می شود. همچنین در پایان چند لینک مناسب در این زمینه جهت استفاده علاقمندان معرفی می گردد.

پیش از شروع توضیح روش کار لازم به ذکر است که چهار محلول مورد استفاده در رنگ آمیزی گرم یا در آزمایشگاه و طبق دستورالعمل های موجود تهیه می شود و یا اینکه هر چهار محلول مورد نیاز در جعبه یا کارتن کوچکی به صورت سری و آماده با عنوان «کیت رنگ آمیزی گرم» خریداری می شود.

مراحل:

(1) تهیه اسمیر: همانند بسیاری از دیگر روش های رنگ آمیزی اولین مرحله تهیه اسمیر (smear) یا گستره (گسترش) است. در این مرحله ابتدا روی سطح لام شیشه ای (اسلاید) یک قطره آب (آب مقطر و یا آب شیر) گذاشته و سپس با استفاده از لوپ سیمی از یک کلنی باکتری مورد نظر (که بهتر است قبلاً خالص شده باشد) برداشته و در این قطره با حرکات بیضی شکل مخلوط می کنیم. پس از خشک شدن اسمیر در معرض هوا با عبور دادن سریع اسلاید از روی شعله برای دو یا سه مرتبه می توان باکتری ها را روی سطح اسلاید چسباند (تثبیت حرارتی).

(2) استفاده از رنگ کریستال ویوله: روی سطح اسمیر با محلول رنگ کریستال ویوله پوشانده می شود. پس از یک دقیقه (البته در دستورالعمل های مختلف ممکن است این زمان ها اندکی متغیر باشند) سطح اسمیر با آب مقطر یا آب شیر (tap water) شستشو می شود.

ریختن رنگ کریستال ویوله روی اسمیر

 

شستشوی رنگ اضافی

 

(3) استفاده از محلول لوگل: سطح اسمیر با محلول لوگل به مدت یک دقیقه پوشانده می شود و سپس محلول اضافی از روی لام شسته می شود. توضیح: محلول لوگل (Lugol’s solution) محلول I2 و KI بوده و با تشکیل کمپلکس های کریستال ویوله-ید در دیواره سلولی باکتری باعث تثبیت رنگ کریستال ویوله در سلول باکتری می شود. در میکروبیولوژی به چنین ترکیباتی اصطلاحاً دندانه (mordant) گفته می شود.

 

(4) استفاده از محلول رنگ بر: سطح اسمیر به مدت 10 تا 15 ثانیه (در برخی منابع 5 تا 10 ثانیه توصیه شده) با محلول رنگ بر پوشانده و سپس بلافاصله محلول اضافی از سطح لام شستشه می شود. البته برای استفاده از محلول رنگ بر می توان لام را به صورت مورب گرفت و محلول رنگ بر را قطره قطره روی سطح اسمیر ریخت و این کار را تا زمانی که در قطراتی که از پایین لام ریخته می شوند رنگ آبی مشاهده نشد ادامه داد. توضیح: محلول رنگ بری که در رنگ آمیزی گرم استفاده می شود ممکن است استون-الکل، اسید-الکل و یا الکل اتیلیک 96 درصد باشد. در هر صورت الکل موجود در این محلول با منعقد کردن پروتئین ها و نیز حل کردن لیپیدها در پوشش سلولی باکتری ها کمپلکس های کریستال ویوله-ید را از سلول هایی که لایه پپتیدوگلیکان دیواره آن ها نازک است بیرون می کشد و آن ها را بی رنگ می کند (این سلول ها در مرحله بعد رنگ سافرانین را به خود می گیرند). سلول هایی که لایه پپتیدوگلیکان دیواره آن ها ضخامت بیشتری دارد کمپلکس های رنگی کریستال ویوله-ید را از دست نمی دهند. [نکته قابل توجه: اگر در این مرحله زمان استفاده از محلول رنگ بر بیش از حد شود ممکن است باکتری های با دیواره ضخیم نیز کمپلکس های رنگی خود را از دست داده و در نتیجه در مرحله بعد رنگ سافرانین را به خود بگیرند و نتیجه رنگ آمیزی اشتباه شود.]

 

(5) استفاده از رنگ سافرانین: این رنگ به عنوان رنگ زمینه (counterstain) باکتری هایی که در مرحله رنگ بری به دلیل ضخامت کمتر در پوشش سلولی خود بی رنگ شده اند را قرمز می کند.

 

(6) خشک شدن لام در معرض هوا

 

(7) مشاهده زیر میکروسکوپ: نتیجه رنگ آمیزی زیر میکروسکوپ به ترتیب با لنزهای شیئی (objective) 4×، 10× و 40× مشاهده می شود و درنهایت از لنز 100× (با استفاده از روغن ایمرسیون) برای بررسی نتیجه استفاده می شود. در استفاده از لنز 100× معمولاً لازم است نور میکروسکوپ روی درجه های بالا برده شود و همچنین تنها از پیچ تنظیمی میکرو برای شفاف شدن میدان دید استفاده شود.

نتیجه زیر میکروسکوپ:

1) باکتری هایی که دیواره ضخیم تری داشته اند و کمپلکس های کریستال ویوله-ید را در مرحله رنگ بری از دست نداده اند آبی دیده می شوند که به آن ها باکتری های گرم-مثبت گفته می شود.

2) باکتری هایی که دیواره نازک تری داشته اند و کمپلکس های کریستال ویوله-ید را در مرحله رنگ بری از دست داده اند رنگ قرمز سافرانین را گرفته اند و لذا قرمز دیده می شوند که به آن ها باکتری های گرم-منفی گفته می شود.

البته همانطور که قبلاً هم بیان شد شکل باکتری ها نیز در کنار نوع واکنش گرم آن ها در چنین حالتی قابل تشخیص خواهد بود.

 

چند لینک مناسب:

لینک اول: فایل انیمیشن که با نرم افزار FlashPlayer اجرا می شود و قابل دانلود از سایت زیر (با کلیک روی گزینه Download Flash Archive) است:

http://www.microbelibrary.org/library/gram-stain/3018-the-gram-stain-an-animated-approach

لینک دوم: توصیفی از رنگ آمیزی گرم به همراه تصاویری از مراحل کار (قابل مشاهده پس از کلیک کردن روی کلمات مورد نظر در متن) از وبلاگی با عنوان «میکروبیولوژی مسجدسلیمان» با آدرس زیر:

http://microbiology1.blogfa.com/post-28.aspx

لینک سوم: مطلبی در مورد این رنگ آمیزی با تصویری گویا از کل مراحل و نتایج قابل انتظار؛ به آدرس زیر:

http://ramin-biology.mihanblog.com/post/63

لینک چهارم: تعدادی Flashcard (به زبان انگلیسی) که به پرسش درمورد این رنگ آمیزی می پردازد؛ به آدرس زیر:

http://www.flashcardmachine.com/gram-staining.html

 

منبع تصاویر استفاده شده در این مطلب از وبلاگ «میکروبیولوژی مسجد سلیمان» است.

موفق باشید