مراحل جداسازی باکتری ها از نمونه های محیطی و بالینی:

درمورد جداسازی (isolation) یک میکروارگانیسم همانطور که از خود کلمه مشخص است به معنای جدا کردن و ایزوله کردن یک میکروب از جمعیت های مخلوط یا همان کانسورتیوم های میکروبی است که در طبیعت و در اکوسیستم ها در کنار یکدیگر میانکنش های مختلف دارند. در مبحث جداسازی یک میکروارگانیسم و یا گروه میکروبی خاص به عنوان هدف درنظر گرفته می شود و روش به گونه ای طراحی می شود که بتوان در نهایت آن میکروب یا گروه میکروبی را به صورت مجزا (ایزوله) در آزمایشگاه داشت.

جداسازی میکروارگانیسم های مختلف دستورالعمل های خاص خود را دارد ولی آنچه در ابتدای چنین مبحثی لازم به توضیح است مراحلی است که تقریباً در بین تمامی انواع جداسازی ها ثابت هستند.

برای جداکردن میکروارگانیسم های هدف از یک نمونه محیطی (خاک، آب، رسوب، لجن، فاضلاب شهری، پساب صنعتی، هوا) و یا یک نمونه بالینی (خون، خلط، مایعات مخاطی، پوست، زخم و غیره) مراحل زیر را می توان به ترتیب نام برد:

(۱) غنی سازی: در این مرحله جمعیت میکروبی خاص و مورد نظر که ممکن است در بین سایر میکروارگانیسم های موجود در نمونه تعداد قابل توجهی نداشته باشد را به روشی خاص افزایش می دهند. این روش ممکن است به صورت کشت در دمای پایین باشد که درمورد برخی باکتری ها اعمال می شود و یا به صورت کشت در محیط کشتی خاص که بر همین اساس به آن محیط کشت غنی کننده گفته می شود. مثلاً برای جداسازی سالمونلا در بسیاری از دستورالعمل ها استفاده از محیط کشت آب پپتونه یا Peptone Water به عنوان محیط کشت غنی کننده در مرحله غنی سازی توصیه می شود.

(۲) کشت های انتخابی: به عنوان مرحله دوم در جداسازی یک میکروارگانیسم معمولاً از کشت های انتخابی برای جلوگیری از رشد میکروارگانیسم های مزاحم که مورد نظر آزمایشگاه نیستند استفاده می شود.

(۳) خالص سازی: در این مرحله لازم است میکروارگانیسم های انتخاب شده و رشد کرده در مرحله قبل به صورت کشت خالص تهیه شده و برای شناسایی و یا هرگونه آزمون میکروبی دیگر آماده شوند. معمولاً از روش کشت خطی یا استریک کردن به شیوه ای خاص برای گرفتن تک کلنی های باکتری ها استفاده می شود.

(۴) شناسایی: برای شناسایی میکروارگانیسم جدا شده از روش های مختلفی بهره گرفته می شود. این روش ها را میتوان به صورت عمده به دو گروه وابسته به کشت و غیر وابسته به کشت تقسیم بندی کرد. در روش های وابسته به کشت یا culture-dependent approaches از انواع محیط های کشت و به ویژه انواع افتراقی استفاده می شود و بر اساس تفاوت واکنش میکروارگانیسم خالص در محیط به شناسایی پرداخته می شود. برای این منظور جداول و دستورالعمل های بسیاری در دسترس محققان وجود دارد. یکی از معروف ترین و البته معتبرترین دستورالعمل های شناسایی باکتری ها کتاب چهار جلدی برگی (Bergy's manual of ...) می باشد که در بسیاری از کتابخانه های تخصصی در دسترس محققان و دانشجویان می باشد. در روش های غیروابسته به کشت یا culture-independent approaches استفاده ای از محیط کشت نمی شود. از جمله چنین روش هایی می توان روش های مولکولی را ذکر کرد که نیاز به بحث و توضیح مجزا و دقیق دارد. دئر این روش های اساساً به بررسی و دنبال کردن ژن های هدف خاص و یا حتی مولکول های خاص در نمونه آماده شده از کشت خالص میکروارگانیسم پرداخته می شود.

(۵) تأیید شناسایی: در اغلب موارد تأیید شناسایی به یک روش مولکولی انجام می شود مثلاً با طراحی پرایمرهای اختصاصی یک ژن خاص در باکتری موردنظر و بررسی حضور این ژن در باکتری جدا شده می توان در مورد صحت جداسازی نتیجه دقیق گرفت. مثلاً ژن تولید توکسین یا سم باکتری موردنظر را می توان به عنوان ژن هدف در چنین روشی در نظر گرفت.

(۶) نگهداری: در نهایت پس از جدا کردن یک میکروارگانیسم خاص از یک نمونه می توان آن را جهت هر گونه آزمایش بعدی در آزمایشگاه نگهداری نمود. برای این منظور از روش های مختلفی استفاده می شود. به عنوان مثال برای نگهداری کوتاه مدت باکتری می توان آن را روی سطح محیط کشت تریپتیک سوی آگار (Tryptic Soy Agar) یا به صورت مختصر TSA که به صورت سطح شیبدار (slant) تهیه شده است کشت داد و در یخچال نگهداری کرد. برای نگهداری طولانی مدت باکتری نیز می توان از کشت غلیظ باکتری در محیط کشت Skim Milk استفاده کرد. روش دیگر نگهداری باکتری برای مدت طولانی تر انتقال کشت غلیط باکتری در حجم مساوی از گلیسیرین استریل شده در یک میکروتیوب است. این میکروتیوب محتوی سلول باکتری را در دمای ۸۰- درجه سانتگراد در فریزهای مخصوص تا مدت طولانی می توان نگهداری کرد. برای نگهداری های باکتری برای مدت های بسیار زیاد اغلب روش لیوفیلیزه کردن (lyophylization) انجام می شود. در این روش کشت باکتری در خلأ و دمای پایین آبگیری می شود و در نهایت از باکتری پودری به دست می آید که در ویال های کوچکی که بدون در بوده و سر آن ها ذوب شده است قابل نگهداری تا زمان بسیار طولانی می باشند.