Microbiology in Action

روش MPN برای شمارش کلی فرم های نمونه های فاضلاب (یا هر نمونه آبی با آلودگی بالا)

هدف آزمایش:

• تعیین تعداد (شاخص MPN) توتال کلی­فرم و فکال کلی­فرم
• نشان دادن میزان آلودگی مدفوعی

نمونه­های مورد سنجش:

• نمونه­های پساب
• نمونه­های آب سطحی با بار آلودگی بالا

کاربرد آزمایش:

کنترل کیفی مراحل مختلف تصفیه­خانه­های فاضلاب و خروجی تصفیه­شده آن­ها توسط آزمایشگاه­های این تصفیه­خانه­ها

استاندارد: استانداردهای شماره 9221 B.، 9221 C. و 9221 E از Standard Methods, 21^st Ed., 2005

روش کار:

این آزمون به شیوه تخمیر چندلوله­ای انجام می­شود و شامل سه مرحله احتمالی، تأییدی و تکمیلی می­باشد.

در مرحله احتمالی چندین سری پنج­تایی از لوله­هایی که هر یک محتوی ml 10 محیط کشت لاکتوز براث هستند تهیه می­شود. سپس رقت­های دهدهی سریال (decimal series of dilutions) از نمونه پساب (یا هر نمونه­ای که بار آلودگی کلی­فرمی بالایی دارد) با استفاده از محلول­های رقیق­کننده تهیه می­شود. از هر یک از این رقت­های تهیه شده از نمونه مقدار ml 1 به هر یک از پنج لوله (یک سری لوله) از لوله­های محیط کشت آماده شده تلقیح می­شود. پس از  2±24 ساعت انکوبه­گذاری لوله­ها در دمای ^OC 5_/0± 35 مشاهده کدورت و گاز نشان دهنده مثبت بودن هر یک از لوله­هاست. درمورد لوله­هایی که در آن­ها کدورت بدون گاز دیده شود این مرحله تا 3±48 ساعت ادامه می­یابد.

در مرحله تأییدی از هر یک از لوله­های مثبت مرحله احتمالی به یک لوله محتوی ml 10 محیط کشت برلیان گرین بایل لاکتوز براث و نیز یک لوله محتوی همین حجم EC براث تلقیح شده و به­ترتیب در دمای ^OC 5_/0± 35 در انکوباتور (برای تعیین توتال کلی­فرم­ها) و در دمای ^OC 2_/0±5_/44 در بن­ماری (برای تعیین فکال کلی­فرم­ها) انکوبه­گذاری می­شوند. تولید گاز در لوله­های برلیان گرین (در هر زمان حداکثر تا 3±48 ساعت) نشان­دهنده رشد توتال کلی­فرم­ها و در لوله­های EC براث (در هر زمان حداکثر تا 2±24 ساعت) نشان­دهنده رشد فکال کلی­فرم­ها در لوله­های مذکور بوده و این لوله­ها به­عنوان لوله مثبت مرحله تأییدی ثبت می­شود. در این مرحله با توجه به نتایج به­دست آمده و بر اساس دستورالعمل استاندارد موجود سه سری از کل لوله­ها یعنی تعداد 15 لوله برای ثبت نتایج انتخاب می­شوند (چگونگی این انتخاب در پایان همین مطلب توضیح داده شده است). با داشتن تعداد لوله­های مثبت مرحله تأییدی برای توتال و فکال به جدول MPN مراجعه کرده (و یا با استفاده از فرمول) و عدد MPN که در واقع حداکثر تعداد احتمالی توتال کلی­فرم­ها و فکال کلی­فرم­ها در نمونه مورد آزمایش است ثبت می­شود. واحد این عدد MPN Index/100 mL می­باشد.

(فرمول مورد استفاده: تعداد کلی فرم ها در ۱۰۰ میلی لیتر نمونه برابر است با عدد MPN خوانده شده از روی جدول برای سه سری لوله انتخاب شده ضرب در ۱۰ تقسیم بر حجم نمونه ای که در یکی از لوله های با کمترین رقت (یا به عبارت دیگر با بیشترین مقدار نمونه در آن لوله) وارد شده است.)

برای اطمینان از حضور کلی­فرم­ها در لوله­های مرحله تأییدی و یا کنترل کیفیت این روش در یک آزمایشگاه می­توان از لوله­های مثبت مرحله تأییدی روی سطح محیط کشت مک کانکی آگار کشت خطی داده و تشکیل کلنی­های تیپیک و آتیپیک کلی­فرم­ها را بررسی کرد. همچنین از این کلنی­ها می­توان مجدداً در محیط لاکتوز براث کشت داد و همزمان جهت رنگ­آمیزی بعدی روی سطح شیب­دار (اسلنت) نوترینت آگار کشت داد.

------------------------------------------------------------------------------

روش انتخاب سه سری لوله از بین کل سری های لوله های کشت شده:

در پایان لازم است روش انتخاب سه سری لوله از بین کل سری های لوله های کشت شده نیز آورده شود. برای این منظور ۵ روش در قالب قاعده در کتاب Standard Methods, Ed. 21th, 2005 (صفحه ۵۳ از بخش نهم این کتاب) ارایه شده که در اینجا بیان می شوند. توضیح نگارنده این مطلب: در این مطلب رقت بیشتر به معنای نمونه کمتر در لوله و رقت کمتر به معنای نمونه بیشتر در لوله است (پس با بحث عددی  ضریب رقت متفاوت است).

قاعده اول: اگر در بین سری های لوله های تأییدی در چند سری پشت سر هم همه مثبت شده بودند می توان آن سری که در آن مقدار کمتری نمونه وارد شده (با رقت بیشتر) را از بین این سری ها انتخاب کرد ودو سری از سری های با مقدار کمتر نمونه در آن ها که بعد از این سری قرار گرفته اند را نیز درنظر گرفت.

مثلاً اگر ۶ سری لوله کشت شده اند و مقدار نمونه در آن ها به ترتیب از بیشتر به کمتر ۱۰، ۱، ۱/۰، ۰۱/۰ و ۰۰۱/۰ میلی لیتر بود و تعداد لوله های مثبت هر یک از این ۶ سری به ترتیب ۵، ۵، ۱، ۰ و ۰ بود باید ۰-۱-۵ انتخاب شده و به جدول مراجعه شود و عدد جدول خوانده شود. فراموش نشود که در نهایت پس از خواندن عدد جدول باید از فرمول ارایه شده در بالا نیز استفاده شود. پس از آنجا که عدد ۰-۱-۵ در جدول MPN پانزده لوله ای ۳۳ ثبت شده پس بر اساس فرمول فوق این عدد باید در ۱۰ تقسیم بر ۱ (حجم نمونه در یکی از لوله های سری با بیشترین مقدار نمونه از بین سه سری لوله های انتخاب شده) ضرب شود که نتیجه ۳۳۰ به دست خواهد آمد.

قاعده دوم: اگر در سری لوله هایی که بیشترین مقدار نمونه وارد شده (کمتر رقیق شده اند) کمتر از ۵ لوله مثبت شده بود همین سری به همراه دو سری بعدی آن درنظر گرفته می شود.

مثلاً اگر ۶ سری لوله کشت شده اند و مقدار نمونه در آن ها به ترتیب از بیشتر به کمتر ۱۰، ۱، ۱/۰، ۰۱/۰ و ۰۰۱/۰ میلی لیتر بود و تعداد لوله های مثبت هر یک از این ۶ سری به ترتیب ۴، ۵، ۱، ۰ و ۰ بود باید ۱-۵-۴ انتخاب شود. عدد این کد در جدول ۴۸ است که طبق فرمول فوق عدد MPN نهایی برای نمونه ۴۸ به دست می آید (چون ۴۸ در ۱۰ تقسیم بر ۱۰ ضرب شده: به فرمول بالا مراجعه شود).

مثال دیگر برای این قاعده: اگر ۶ سری لوله کشت شده اند و مقدار نمونه در آن ها به ترتیب از بیشتر به کمتر ۱۰، ۱، ۱/۰، ۰۱/۰ و ۰۰۱/۰ میلی لیتر بود و تعداد لوله های مثبت هر یک از این ۶ سری به ترتیب ۰، ۰، ۱، ۰ و ۰ بود باید ۱-۰-۰ انتخاب شود و دوباره از فرمول استفاده شود. چون عدد جدول برای این کد ۸/۱ است این عدد در ۱۰ تقسیم بر ۱۰ ضرب شده و نتیجه نهایی به دست می آید.

قاعده سوم: این روش اندکی پیچیده تر از دو قاعده قبل است. اگر سه سری لوله انتخاب شد (طبق قواعد بالا) و در یک سری از سری هایی که انتخاب نشده اند و مقدار نمونه در آن ها کمتر از سری های انتخاب شده است یک نتیجه مثبت وجود داشت باید انتخاب تغییر داده شود. به این صورت که اولین سری انتخابی باید سری با بیشترین نمونه و البته با کمتر از پنج لوله مثبت باشد و دو سری انتخابی بعدی هم شامل سری های بعد ان با مقدار نمونه کمتر باشند به صورتی که سری با یک لوله مثبت هم در انتخاب قرار گیرد.

مثلاً اگر ۶ سری لوله کشت شده اند و مقدار نمونه در آن ها به ترتیب از بیشتر به کمتر ۱۰، ۱، ۱/۰، ۰۱/۰ و ۰۰۱/۰ میلی لیتر بود و تعداد لوله های مثبت هر یک از این ۶ سری به ترتیب ۵، ۴، ۴، ۱ و ۰ بود باید ۱-۴-۴ انتخاب شود (نه ۰-۱-۴ و نه ۴-۴-۵). عدد این کد در جدول ۴۰ است که باید در ۱۰ تقسیم بر ۱ ضرب شود که نتیجه نهایی برای نمونه ۴۰۰ به دست می آید.

قاعده چهارم: اگر با درنظر گرفتن هریک از سه مورد فوق سه سری لوله انتخاب شد ولی باز هم در سری لوله هایی که نمونه کمتری در آن ها وارد شده (بیشتر مورد رقیق سازی قرار گرفته اند) لوله یا لوله های مثبتی وجود داشت این لوله های مثبت را باید با تعداد لوله های مثبت در سری انتخاب شده ای که کمترین نمونه در آن ها وارد شده جمع کرد.

مثلاً اگر ۶ سری لوله کشت شده اند و مقدار نمونه در آن ها به ترتیب از بیشتر به کمتر ۱۰، ۱، ۱/۰، ۰۱/۰ و ۰۰۱/۰ میلی لیتر بود و تعداد لوله های مثبت هر یک از این ۶ سری به ترتیب ۵، ۴، ۴، ۰ و ۱ بود باید ۰-۴-۴ انتخاب شود ولی یک لوله سری با نمونه کمتر که انتخاب هم نشده به سری انتخاب شده اضافه شود. پس باید کد ۱-۴-۴ درنظر گرفته شود. عدد این کد در جدول ۴۰ است و با توجه به فرمول نتیجه نهایی MPN چنین نمونه ای ۴۰۰ خواهد بود.

قاعده پنجم: اگر با درنظر گرفتن تمامی قوانین فوق در همه سری لوله ها و از جمله در سری لوله های باکمترین مقدار نمونه (بیشترین رقیق سازی) لوله های مثبت وجود داشت و سری های با نمونه کمتری کشت نشده بودند تا بتوان از قواعد قبلی در انتخاب سه سری لوله استفاده کرد باید سری با کمترین مقدار نمونه را به همراه دو سری قبل آن (با مقدار نمونه بیشتر) در نظر گرفت.

مثلاً اگر ۶ سری لوله کشت شده اند و مقدار نمونه در آن ها به ترتیب از بیشتر به کمتر ۱۰، ۱، ۱/۰، ۰۱/۰ و ۰۰۱/۰ میلی لیتر بود و تعداد لوله های مثبت هر یک از این ۶ سری به ترتیب ۵، ۵، ۵، ۵ و ۲ بود باید ۲-۵-۵ درنظر گرفته شود و به جدول مراجعه شود. در جدول برای این کد عدد ۵۴۰ ذکر شده که با توجه به فرمول عدد MPN این نمونه ۵۴۰۰۰ محاسبه می شود که البته می توان آن را به صورت نماد علمی هم ثبت کرد.

منبع قواعد انتخاب سری ها: Standard Methods, 21th ed., 2005-صفحه ۵۳ از بخش نهم